Изоляция и монослойное культивирование субпопуляций человеческих лимфоцитов

Введение. Активная пролиферация и выживаемость мутантных гемопоэтических стволовых клеток (мГСК), лежащие в основе формирования и прогрессирования лейкозов, детерминированы взаимодействием с нишей костного мозга (КМ) и другими клеточными популяциями, такими как мезенхимальные стромальные клетки [1]. Несмотря на успех последних лет в применении Т-клеточной терапии химерным антигенным рецептором (CAR) и многообещающих перспектив для лечения онкогематологических заболеваний, ее применение при остром миелоидном лейкозе затруднено гетерогенностью опухоли и нецелевой токсичностью [2]. Сочетание редактирования генома CRISPR-Cas9 с терапией CAR-T-клетками имеет потенциал для избирательного воздействия на клетки при остром миелоидном лейкозе, сохраняя при этом здоровые ткани [3]. Тем не менее проверка эффективности этих методов лечения до клинических испытаний затруднена из-за различий между моделями на людях и животных, традиционных для доклинических испытаний. Поддержание ГСК in vitro [4] является сложной задачей, поскольку выживание и дифференцировка стволовых клеток во многом зависит от межклеточного контакта и паракринных сигналов, которые пространственно организованы в различных областях КМ, обеспечивая поддержание стволовости или способствуя дифференцировке зрелых клеток [5]. По этим причинам воспроизведение сложных перекрестных связей и микроархитектуры in vitro является чрезвычайно сложной задачей [6]. Системы 3D-культивирования, такие как гидрогели с альгинатом натрия и кальция, эффективно воспроизводят структуру ткани и поддерживают рост CD34+CD38– - стволовых и CD34+CD38+-клеток-предшественников, используя различные биоинженерные каркасы [7, 8]. Еще одним известным способом улучшения долгосрочного поддержания in vitro предшественников ГСК является усовершенствование состава питательной среды, например за счет включения основного фактора роста фибробластов (bFGF) вместе с дексаметазоном, аскорбиновой кислотой и β-глицерофосфатеином [9]. Другими цитокинами и факторами роста, которые обычно добавляют в культуральную среду, являются интерлейкины (ИЛ) ИЛ-3 и ИЛ-16, гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор, эритропоэтин, фактор стволовых клеток, тромбопоэтин, растворимая fms подобная тирозинкиназа [10]. Существуют также дополнительные соединения, обладающие способностью сохранять стволовость ГСК, такие как стволовой регенин-1 и 16,16-диметилпростагландин Е2 [11]. Таким образом, исходя из вышеизложенного, традиционные модели in vitro часто не способны полноценно воспроизвести сложную нишу КМ. Цель настоящей работы состоит в создании и оценке потенциала биоинженерной in vitroмодели эндотелиальной ниши КМ для поддержки и активации ГСК человека. Предлагаемая модель будет сочетать полимерную поверхность, презентирующую фибронектин, и синтетическую полиаминокислоту (поли-D-лизин), которые имитируют механические свойства нативной ткани КM. Материал и методы. В работе использованы мононуклеарные клетки периферической крови (peripheral blood mononuclear cells – PBMC) человека. В эксперимент включены образцы от 20 здоровых добровольцев. Исследование выполнено в соответствии со стандартами надлежащей клинической практики (Good Clinical Practice) и принципами Хельсинской декларации. Протокол исследования был одобрен локальным этическим комитетом при ФГБОУ ВО «Саратовский ГМУ им. В.И. Разумовского» Минздрава России. До включения в исследование от всех участников было получено письменное информированное согласие. Для выполнения исследований готовили набор растворов, питательных сред и буферов с использованием коммерческих реагентов, произведенных компанией Himedia (Индия). Раствор А, состоящий из фосфатно-солевого буфера (PBS) pH=7,4 с добавлением 2%-й фетальной бычьей сыворотки. Раствор B, состоящий из PBS с добавлением 0,5%-го бычьего сывороточного альбумина и 2 мM этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА). Полная питательная среда культивирования Т-лимфоцитов включала базовую среду RPMI-1640 с добавлением L-глутамина, 20 мM HEPES (4-(2-гидроксиэтил)-1- пиперазинэтансульфоновой кислоты), 10%-й сыворотки эмбриональной бычьей, 1 мM пирувата натрия, 1,5 мг/мл бикарбоната натрия, 100 Ед/мл пенициллина – стрептомицина, 200 Ед/мл человеческого рекомбинантного ИЛ-2. Параллельно готовили платформы с активированными рабочими поверхностями для культивирования лимфоцитов четырьмя различными способами. Основой служили стандартные 24-луночные полистироловые планшеты для культивирования клеток (Sarstedt, Германия). Платформа 24T_FN: в лунки планшета вносили 200 мкл 50 мкг/ мл раствора фибронектина в стерильном PBS. Планшет закрывали лентой Parafilm M и инкубировали 12 ч при температуре 4ºC, затем освобождались от несвязавшегося фибронектина двукратной промывкой в PBS (по 800 мкл). Платформа 24T_pDl: в лунки планшета вносили 200 мкл 100 мкг/мл раствора поли-D-лизина в стерильном PBS. Планшет закрывали лентой Parafilm M и инкубировали 12 ч при температуре 4ºC, затем освобождались от несвязавшегося поли-D-лизина двукратной промывкой в PBS. Платформа 24T_FN@pDl: в лунки планшета вносили 200 мкл 50 мкг/мл раствора фибронектина в стерильном PBS и инкубировали при комнатной температуре в течение 3 ч, затем освобождались от несвязавшегося фибронектина двукратной промывкой в PBS. Затем в лунки вносили 200 мкл 100 мкг/мл раствора поли-D-лизина в стерильном PBS. Планшет закрывали лентой Parafilm M и инкубировали 12 ч при температуре 4ºC, затем освобождались от несвязавшегося поли-D-лизина двукратной промывкой в PBS. Платформа 24T_pDl@AbCD3: в лунки вносили по 200 мкл раствора поли-D-лизина в стерильном PBS в концентрации 0,1 мг/мл и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 ч. Затем дважды промывали лунки с помощью PBS (по 800 мкл), после чего добавляли по 200 мкл раствора 30 мкг/ мл стрептавидина в PBS, и инкубировали планшет в термостате в течение 1 ч при температуре 37ºC. Удаляли раствор из лунок и, не промывая планшет, помещали в лунки по 500 мкл 1% BSA в PBS с последующей инкубацией в течение 30 мин при комнатной температуре. Удаляли раствор и промывали лунки с помощью PBS (по 800 мкл). Далее помещали в планшет по 300 мкл человеческих биотинилированных антител к CD3 (5 мкг/мл; Elabscience, Китай) в PBS. Последний ряд лунок (по 4 шт. в каждом планшете) не подвергали какой-либо обработке, и использовали в качестве контрольных. Подготовленные таким образом 4 типа платформ хранили до проведения экспериментов не более 1 нед при температуре 4ºC, с залитыми до ½ объема лунок PBS и обмотанные Parafilm M для предотвращения испарения. Типичная экспериментальная процедура выглядела следующим образом. Забор периферической венозной крови осуществляли стандартной венепункцией в вакуумные пробирки с антикоагулянтом (К3-ЭДТА). Изоляцию Т-клеток из фракции PBMC осуществляли общепринятым методом градиентного центрифугирования в градиенте плотности фиколлурографина [12]. Свежую порцию цельной крови объемом 5 мл смешивали эквиобъемно с раствором А и очищали в градиенте Ficoll-Paque плотностью 1,077 г/мл центрифугированием 30 мин при 400 g. Аккуратно собирали кольцо PBMC между средой/ плазмой и фиколлом, далее лимфоцитарную массу трижды отмывали смесью растворов А и В (в соотношении 1:9) от Ficoll-Paque, центрифугируя 10 мин при 200 g. Полученную суспензию клеток доводили питательной средой до концентрации 1,5×106 / мл и вносили по 800 мкл в лунки тестовых платформ, Выживаемость и адгезионная активность лимфоцитов, культивированных на платформах с активированной поверхностью Параметр/значение* Тестовые платформы Контроль 24T_FN 24T_pDl 24T_FN@pDl 24T_pDl@AbCD3 Тип активатора Фибронектин Поли-Dлизин Фибронектин и поли-D-лизин Поли-D-лизин и анти-CD3-антитела – Площадь поверхности 1,92 1,92 1,92 1,92 1,92 Стартовое количество клеток, ×106 , M±SD 1,21±0,08 1,23±0,07 1,22±0,09 1,21±0,06 1,22±0,05 Количество живых клеток на 3-и сутки, % 84±8 92±7 87±7 85±9 75±9 Количество живых клеток на 7-е сутки, %* 88±11 93**±6 85±8 83±7 77±9 Количество крупных конгломератов (>100 клеток), M±SD 26**±3 12±5 – – 18±3 Количество малых конгломератов (50–100 клеток), M±SD 13**±2 33**±7 10**±2 6**±3 – Адгезионная активность на 7-е сутки, %* 68**±9 62**±5 83**±10 88**±7 23±3 *Данные приведены на единичную рабочую поверхность и нормированы по стартовому количеству клеток; **p<0,05 подготовленных, как описано выше. Поддержание клеток осуществляли в клеточном инкубаторе Innova (New Brunswick Scientific, Германия) при температуре 37ºС во влажной атмосфере со средним содержанием CO2 на уровне 5% в течение 7 сут. Оценку количества клеток в популяции и их жизнеспособности производили ежедневно на автоматическом счетчике клеток TC20 (BioRad, США), для этого переводили клетки в суспензионную форму трипсинизацией и окрашивали 0,4% трипановым синим. Визуальный контроль состояния клеточных популяций осуществляли методом фазово-контрастной микроскопии с использованием инвертированного флуоресцентного микроскопа NIB620FL (Nexcope, Китай). На 7-й день эксперимента проводили анализ адгезии лимфоцитов. Для этого освобождали лунки от питательной среды и удаляли неприкрепившиеся клетки деликатной 7-кратной промывкой PBS. Выбранные случайным образом 10 полей зрения на лунку анализировались с помощью стандартного алгоритма Fiji [13] для определения количества прикрепленных лимфоцитов на поле зрения. Статистическая обработка полученных данных проведена при помощи стандартных пакетов Microsoft Exсel 2010. Полученные количественные данные представлены в виде средних значений и стандартного отклонения (M±SD), а категориальные – в виде долей и их ошибок, которые были рассчитаны для значений, нормированных на общее число клеток в монослое по результатам трех независимых экспериментов (при оценке доли жизнеспособных клеток). Для статического сравнения средних значений количественных данных между опытной и контрольной группами использовали параметрический t-критерий Стьюдента, для сравнения долей (учитывая небольшой размер выборки) – точный критерий Фишера. При p≤0,05 различия между группами считали достоверными. Результаты. Культивирование лимфоцитарных клеток, изолированных из фракции PBMC, проведено на специально подготовленных платформах с различными активированными поверхностями в течение 7 дней. Ежедневный визуальный микроскопический мониторинг в течение всего периода тестового культивирования, а также анализ жизнеспособности с применением витального окрашивания трипановым синим на 3-и и 7-е сутки эксперимента продемонстрировали высокие показатели для всех предложенных вариантов платформ, существенно не отличающиеся от контроля (таблица), а также неизменную типичную для лимфоцитов округлую или слегка овальную морфологию клеток с крупным ядром. Следует отметить, что характер распределения сгруппированных клеток и их более крупных конгломератов по поверхности лунок существенно различался между опытными группами и контрольным вариантом. Так, в монослоях клеток, культивированных на платформе 24T_FN, начиная со 2-го дня появлялись хаотично распределенные клеточные группировки, со скоплениями в одном месте, и свободными от клеток обширными областями. Краевых эффектов при этом не отмечено: во всех тестовых лунках платформы 24T_FN адгезированных клеток практически не обнаруживалось. Напротив, в случае использования поли-D-лизинового покрытия равномерность распределения клеток была значительно выше по всей поверхности лунки, с образованием малочисленных, в пределах 50–100 клеток, отдельных скоплений. Показатели адгезионной активности клеток на 7-й день эксперимента на платформах 24T_ FN и 24T_pDl были на уровне 60–70% и сопоставимы между собой, при этом практически в 3 раза превосходили контрольный вариант (см. табл.). Наилучшие показатели выживаемости лимфоцитов и адгезионной активности – на уровне более 80% – продемонстрировали комбинированные платформы 24T_FN@ pDl и 24T_pDl@AbCD3. Распределение клеток на последних платформах наблюдалось по всей рабочей поверхности, с минимальным количеством мелких конгломератов в случае 24T_FN@pDl, и практическим их отсутствием для варианта 24T_pDl@AbCD3 (см. табл.). Таким образом, по результатам проведенных исследований наиболее предпочтительным кандидатом для равномерного монослойного культивирования лимфоцитарных клеток и высокой степенью адгезии была выбрана платформа 24T_pDl@AbCD3 с активатором поверхности в виде полимерной формы положительно заряженной аминокислоты полиD-лизина в комбинации с антителами, аффинными к CD3+-Т-клеткам. Обсуждение. Монослойное культивирование in vitro первичных донорских клеток, несмотря на кажущуюся простоту, является достаточно трудоемким процессом и требует индивидуального подхода в зависимости от решаемой задачи на модели, морфофункциональных характеристик клеток и параметров их микроокружения. Лимфоциты человека, будучи одними из активных клеточных компонентов, свободно циркулирующих в кровяном русле, имеют четкую функциональную детерминированность, опосредованную иммунными факторами, прежде всего цитокинами. Успех культивирования в лабораторных условиях лимфоцитов, в частности Т-клеток, требует создания специальных условий и добавок в питательные среды. В настоящей работе мы протестировали ряд наиболее изученных активаторов для улучшения адгезионных свойств клеточной поверхности и оценили их влияние на базовые физиологические параметры лимфоцитов. Фибронектин, представляющий собой линейно-разветвленный биополимер, – один из традиционных модификаторов, применяемых в исследованиях на культурах клеток [14]. Природоподобные свойства фибронектина, являющегося одним из компонентов внеклеточного матрикса клеток соединительной ткани, в том числе и ГСК, обусловливают высокую хорошую приживаемость и повышение адгезионных свойств культивируемых клеток. Однако высокая степень разветвленности высокомолекулярных полимерных нитей фибронектина ограничивают его использование вследствие склонности к образованию конгломератов клеток. Так, наши наблюдения для платформы 24T_FN выявили подобную тенденцию к образованию крупных агрегатов и неравномерному распределению клеток. Другой вариант активатора, поли-D-лизин, активно применяемый для улучшения адгезионных свойств [15], работает по принципу электростатического притяжения клеток. Поли-D-лизин является полимерным производным аминокислоты D-лизина с большим количеством экспонированных катионных группировок, обеспечивающих активный положительный заряд для притяжения клеток с отрицательно заряженной поверхностью. Лимфоциты относятся к классу клеток, имеющих высокий отрицательный поверхностный заряд. В отличие от крупного разветвленного фибронектина с массой 440–550 кДа, поли-D-лизин является более низкомолекулярным линейным полимером с массой 70–150 кДа, что обеспечивает более равномерное покрытие для культивируемых клеток. Наконец, комбинация полимерного активатора с аффинными антителами к клеточной поверхности (в нашем случае – CD3+), способными селективно сорбировать целевую субпопуляцию из общей биомассы в процессе культивирования, представляется компромиссным вариантом для достижения одновременно улучшенной адгезии и in situ изоляции клеток-мишеней. Таким образом, в ходе проведенных исследований была продемонстрирована возможность монослойного культивирования лимфоцитарных клеток, изолированных из общей фракции PBMC человека, и пригодных для проведения дальнейших исследований, необходимых на этапе разработке биоинженерных решений, в том числе иБМКП. Последующая работа может быть сосредоточена на уточнении фенотипического статуса, детальной оценки морфоцитохимических параметров лимфоцитарных клеток с применением подходов магнитной иммуносепарации для более качественной изоляции субпопуляций Т-клеток. Расширенный инструментальный анализ биохимического профиля и иммунного статуса может быть проведен методами проточной цитометрии, иммуноферментного анализа, ПЦР-анализа транскриптома и методом высокопроизводительного секвенирования. Заключение. В результате проведенных экспериментов выбран наиболее предпочтительный вариант монослойного культивирования лимфоцитарных клеток с высокими степенями равномерности 2D-распределения и адгезии клеток: платформа 24T_pDl@AbCD3 с активатором поверхности в виде полимерной формы положительно заряженной аминокислоты поли-D-лизина в комбинации с антителами, аффинными к CD3+-Т-клеткам. Предлагаемая платформа поддерживает нишевые фенотипы Т-клеток и мГСК, что позволяет оценивать эффективность CAR-Т-конструкций, демонстрируя потенциал в качестве доклинической человеческой модели для тестирования новых методов лечения на основе иБМКП. Источники финансирования. Работа выполнена в рамках государственного задания ФГБОУ ВО «Саратовский государственный медицинский университет им. В.И. Разумовского» Минздрава России «Разработка системы доставки терапевтических нуклеиновых кислот и биомедицинских клеточных продуктов для целей CAR-T-терапии онкогематологических заболеваний на основе инновационной технологии лазерной трансфекции» (регистрационный номер 25030703343-1). Вклад авторов: Т.Е. Пылаев – дизайн статьи, обработка данных, написание и редактирование рукописи; А.К. Суркина – исследования (культуральные работы), редактирование рукописи. Все авторы одобрили финальную версию статьи перед публикацией, выразили согласие нести ответственность за все аспекты работы, подразумевающую надлежащее изучение и решение вопросов, связанных с точностью или добросовестностью любой части работы. Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Литература:
1. Копнин Б.П. Cовременные представления о механизмах злокачественного роста: сходства и различия солидных опухолей и лейкозов. Клиническая онкогематология. 2012;5(3):165-85.
2. Lin Y, Luo S, Wei J, et al. Limitations of CAR-T-Cell therapy in hematologic malignancies: Focusing on antigen escape and T-cell dysfunction. Int J Mol Sci. 2025;26(19):9669. DOI:10.3390/ijms26199669
3. Tao R, Han X, Bai X, et al. Revolutionizing cancer treatment: enhancing CAR-T cell therapy with CRISPR/Cas9 gene editing technology. Front Immunol. 2024;15:1354825. DOI:10.3389/fimmu.2024.1354825
4. Mallone R, Mannering SI, Brooks-Worrell BM, et al. Isolation and preservation of peripheral blood mononuclear cells for analysis of islet antigen-reactive T cell responses: Position statement of the T-Cell Workshop Committee of the Immunology of Diabetes Society. Clin Exper Immunol. 2011;163(1):3349. DOI:10.1111/j.1365-2249.2010.04272.x
5. Свитич О.А., Калиниченко Е.О., Бишева И.В. и др. Выделение и культивирование γδτ-лимфоцитов из тканей и органов человека и животных: основные подходы. Обзор литературы. Медицинский вестник МВД. 2025;5:81-4.
6. Doherty-Boyd WS, Donnelly H, Tsimbouri MP, et al. Building bones for blood and beyond: the growing field of bone marrow niche model development. Experiment Hematol. 2024;135:104232. DOI:10.1016/j.exphem.2024.104232
7. Manzo P, Scala P, Giudice V, et al. c-Kit M541L variant is related to ineffective hemopoiesis predisposing to clonal evolution in 3D in vitro biomimetic co-culture model of bone marrow niche. Heliyon. 2022;8(12):e11998. DOI:10.1016/j.heliyon.2022.e11998
8. Lee JW, Kim HS, Yon SJ, et al. In vitro culture of hematopoietic stem cell niche using angiopoietin-1-coupled alginate hydrogel. Int J Biol Macromol. 2022;209(Pt B):1893-9. DOI:10.1016/j.ijbiomac.2022.04.163
9. Pitaru S, Kotev-Emeth S, Noff D, et al. Effect of basic fibroblast growth factor on the growth and differentiation of adult stromal bone marrow cells: Enhanced development of mineralized bone-like tissue in culture. J Bone Miner Res. 1993;8(8):919-29. DOI:10.1002/jbmr.5650080804
10. Yadav P, Vats R, Bano A, et al. Hematopoietic stem cells culture, expansion and differentiation: An insight into variable and available media. Int J Stem Cells. 2020;13(3):326-34. DOI:10.15283/ijsc19157
11. Rai R, Naseem A, Vetharoy W, et al. An improved medium formulation for efficient ex vivo gene editing, expansion and engraftment of hematopoietic stem and progenitor cells. Mol Ther Methods Clin Dev. 2023;29:58-69. DOI:10.1016/j. omtm.2023.02.014
12. Ruitenberg JJ, Mulder CB, Maino VC, et al. VACUTAINER CPT and Ficoll density gradient separation perform equivalently in maintaining the quality and function of PBMC from HIV seropositive blood samples. BMC Immunol. 2006;7:11. DOI:10.1186/1471-2172-7-11
13. Schindelin J, Arganda-Carreras I, Frise E, et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 2012;9:676-82. DOI:10.1038/nmeth.2019
14. Arredondo R, Poggioli F, Martínez-Díaz S, et al. Fibronectin-coating enhances attachment and proliferation of mesenchymal stem cells on a polyurethane meniscal scaffold. Regen Ther. 2021;18:480-6. DOI:10.1016/j.reth.2021.11.001
15. Tsang M, Gantchev J, Ghazawi FM, Litvinov IV. Protocol for adhesion and immunostaining of lymphocytes and other non-adherent cells in culture. BioTechniques. 2021;63(5):230-3. DOI:10.2144/000114610