Фундаментальные аспекты и особенности клинического применения молекулярно-цитогенетического анализа хромосомных нарушений (обзор)

Введение. Современная молекулярно-генетическая диагностика in vitro (in vitro diagnostics – IVD) направлена на получение высокоточной информации о локализации, типе и клинической значимости ожидаемых перестроек генома у каждого отдельного пациента. Информация о мутациях и их сочетаниях помогает выбрать наиболее эффективную тактику лечения выявленной патологии или уточнить степень риска наследственных заболеваний. Данный обзор посвящен наблюдению основных параметров молекулярно-цитогенетического анализа, последним достижениям и проблемам разрабатываемых технологий. Метод анализа дифференциально окрашенных хромосом, также называемый флуоресцентной гибридизацией in situ (fluorescence in situ hybridization – FISH) [1], является «золотым стандартом» в диагностике хромосомных заболеваний. Метод FISH реализуется на основе целенаправленных ДНК-зондов, меченных флуорофором, с последовательностями, комплементарными интересующему участку ДНК [2]. Специфический сигнал усиливается посредством специфической гибридизации меченного красителем ДНК-зонда в сайте-мишени, соответствующем хромосомной аберрации, который впоследствии фиксируется с помощью флуоресцентной микроскопии. Однако стандартная технология FISH ограничена более низким пространственным разрешением приблизительно 10 млн пар оснований [3], что соответствует уровню обнаружения крупных хромосомных аномалий. Другим существенным недостатком является относительно низкий срок службы красителей, используемых для мечения ДНК-зондов вследствие фотообесцвечивания люминофоров. Перечисленные ограничения, а также относительно высокая стоимость реагентов не позволяют использовать FISH-анализ в качестве метода скрининга. Таким образом, разработка новых и совершенствование существующих платформ в условиях повышения разрешения и надежности ДНК-зондов остается актуальной задачей, решение которой выведет молекулярноцитогенетический анализ на принципиально новый уровень. Цель – определить ключевые молекулярно-цитогенетические технологии анализа хромосомных нарушений, направленные на своевременную диагностику и мониторинг социально значимых наследственных заболеваний человека. Методика написания обзора. Систематический обзор выполнен по методологии PRISMA (Preferred reporting items for systematic reviews and metaanalyses – «Предпочтительные элементы отчетности для систематических обзоров и метаанализов») с использованием баз данных PubMed, eLibrary, CyberLeninka, Google Scholar. Глубина поиска – с 2000 по 2025 г. Поиск проводился по следующим ключевым словам: “molecular cytogenetics”, “chromosomal diseases”, “chromosomal aberrations”, “fluorescence in situ hybridization”, “gene diagnostics”, включая их русскоязычный перевод: «молекулярная цитогенетика», «хромосомные заболевания», «хромосомные аберрации», «флуоресцентная гибридизация in situ», «генетическая диагностика». Были проанализированы полнотекстовые источники для наиболее точного изучения публикаций, имеющих непосредственное отношение к предметной области обзора. Дублирующие публикации, обзорные статьи, не имеющие детального описания результатов исследований, авторские мнения были исключены из результатов поискового запроса. Преобладающее большинство публикаций по рассматриваемой в обзоре теме представлено в англоязычном секторе. После тщательного фильтра источников по критериям исключения в обзор вошло 50 статей для раскрытия указанной темы (рисунок). Результаты обзора. Молекулярно-цитогенетический анализ – «золотой стандарт» современной диагностики хромосомных нарушений. Развитие молекулярных методов и подходов получения нативных препаратов хромосом привело к разработке и успешному внедрению зондов для FISH-анализа [4] в рутинную лабораторную практику. С появлением технологии FISH стало доступным выявление хромосомных аномалий, которые выходили за пределы разрешения традиционного анализа полос при кариотипировании [5]. FISH-зонды широко используются в клинической практике на протяжении последних 25 лет для обнаружения микроделеций [6], микродупликаций [7], хромосомных транслокаций [8], обнаружения специфических слияний генов [9], возникающих в результате хромосомных перестроек, подсчета хромосом в интерфазных ядрах [10], количественной оценки уровня транскриптов [11], обнаружение лимфом и других гематологических заболеваний [12], мониторинга первичного опухолевого процесса [13]. В качестве альтернативы методу FISH для диагностики онкогематологической патологии можно рассматривать методы пиросеквенирования [14] и секвенирования нового поколения [15]. Однако оба эти метода, с одной стороны, требуют дорогостоящего оборудования и реагентов для обнаружения расширенных мутаций. С другой стороны, методы секвенирования являются непрямыми и не позволяют визуализировать хромосомные аберрации, а также количественно оценить мутационную нагрузку, нормированную по количеству клеток. С момента изобретения в 1990-х гг. по настоящее время молекулярная цитогенетика претерпела эволюцию от специфических FISH-зондов к отдельным мишеням [16] до полногеномного анализа с появлением методов хромосомной сравнительной геномной гибридизации (comparative genomic hybridization – CGH) [17] и хромосомного микроматричного анализа (chromosomal microarray analysis – CMA) [18]. Несмотря на то, что метод CGH изначально использовался для обнаружения дисбаланса числа аберрантных копий по всему геному в образцах новообразований, была продемонстрирована клиническая значимость для пациентов с конституциональными хромосомными аномалиями [19]. В первое десятилетие XXI в. наблюдался рост популярности CMA для повышения диагностической эффективности у пациентов с врожденными аномалиями и умственной отсталостью [20], в то время как CMA для выявления пренатальных [21] синдромов получила развитие только во втором десятилетии 2000-х гг. Следующий крупный сдвиг в технологии анализа хромосом произошел с развитием секвенирования следующего поколения (next generation sequencing – NGS). Методы NGS используется как для таргетной (например, для неинвазивного пренатального генетического тестирования) [22], так и для полногеномной оценки хромосомных аномалий [23], однако оба варианта не могут быть рассмотрены в качестве скрининговых, и требуют существенного биоинформационного постанализа. Характеристика ДНК-зондов и меток, применяемых для молекулярно-цитогенетического анализа. Эффективность FISH-анализа в современных научных исследованиях и лабораторной практике обеспечивается благодаря следующим особенностям: (1) уникальные ДНК-зонды, которые гибридизуются на соответствующих зонах участков целевых хромосом посредством комплементарного связывания; (2) обширный спектр доступных флуорохромов с широкими спектральными характеристиками и люминесцентными свойствами; (3) высокое пространственное разрешение флуоресцентной микроскопии; (4) частично или полностью автоматизированные аналитический и постаналитический этапы [24]. Еще одним адаптивным преимуществом FISH-анализа является вариабельность совместимых типов биоматериала, включая периферическую кровь, костный мозг, образцы биопсии опухоли, фрагменты плацентарной ткани, эмбриональные ткани или околоплодные воды [25]. Тем не менее имеются определенные ограничения из-за необходимости использования свежеприготовленных препаратов, полученных непосредственно из образцов живых тканей и клеток или после их предварительного культивирования. Для анализа могут быть использованы как метафазные [26], так и интерфазные препараты хромосом [27]. Ключевыми предпосылками успешной реализации метода FISH считаются правильно приготовленные препараты с упорядоченными хромосомами (кариотипом) и эффективно гибридизованный зонд с правильно функционирующей флуоресцентной меткой. Последнее предполагает использование ДНК-зондов, конъюгированных метками со стабильным флуоресцентным сигналом, а также низкое или полное отсутствие неспецифического/фонового окрашивания [28]. Под сигналом понимается пятно, видимое в поле зрения микроскопа, с характерной локализацией в целевом локусе или исследуемой хромосоме [24]. Известно несколько ферментативных методов мечения зондов, включая трансляцию, случайное праймирование [29] и мечение с помощью ПЦР-амплификации. Мечение нуклеотидными аналогами зондов, полученных путем ник-трансляции [30], конъюгации с флуорохромом или гаптеном [31], может быть осуществлено прямым или непрямым вариантами мечения соответственно [19]. Гаптен визуализируют с помощью вторичных антител, конъюгированных с флуорохромом. Непрямое мечение требует дополнительных шагов и реагентов по сравнению с вариантом прямого мечения, и оба варианта имеют свои преимущества и недостатки с точки зрения чувствительности и простоты сигнала. ДНК-зонды, используемые для молекулярно-цитогенетического анализа, имеют широкий диапазон параметров в зависимости от целевой специфичности, хромосомного расположения анализируемой аномалии, особенностей кластеризации генов и, в некоторой степени, нуклеотидного состава. ДНК-зонды различаются по размеру молекул-мишеней: от перекрывающих всю хромосому до сайтспецифических на конкретную хромосому или локус гена. Согласно одной из классификаций, ДНК-зонды по целевым параметрам можно разделить на локус-специфические зонды, связывающиеся с определенными участками хромосом [32]; полнохромосомные зонды, позволяющие маркировать всю хромосому и получать дифференциальный спектральный кариотип; зонды, распознающие специфическую целевую последовательность ДНК, которую используют для получения меченого зонда и его последующей гибридизации с набором хромосом. Другая классификация основана на химическом строении и способах изготовления ДНК-зондов, согласно которой различают два основных типа: протяженные зонды длиной более нескольких сотен нуклеотидов, и короткие зонды, называемые также олигонуклеотидными ДНК-зондами. Протяженные зонды получают из библиотеки бактериальных клонов (бактериальная искусственная хромосома – bacterial artificial chromosome, BAC) [33], каждый из которых содержит фрагмент ДНК, соответствующий определенному участку генома человека размером ~150 тыс. пар нуклеотидов. Эта технология в первую очередь ограничена доступностью клонов: геном человека состоит из 3 млрд пар оснований, но типичная библиотека BAC включает только примерно 20 тыс. клонов. Это ограничивает выбор зондов и может привести к низкой специфичности зонда в целевой области интереса. Во-вторых, BAC-зонды получены из фрагментированной геномной ДНК человека, поэтому они включают множество встречающихся в природе повторяющихся последовательностей. В-третьих, воспроизведение технологии на основе BAC является трудоемким и дорогим процессом, поскольку используемые последовательности ДНК аналогичны природным и требуют соответствующих ресурсов для обслуживания и биобанкинга. Компромиссным вариантом ДНК-зондов для FISH-анализа являются олигонуклеотидные зонды – искусственно синтезированные фрагменты ДНК, последовательность которых комплементарна последовательности ДНК хромосом-мишеней [34]. Олигонуклеотидные зонды могут быть сконструированы таким образом, чтобы они обладали специфическими термодинамическими свойствами и были запрограммированы на участки экзогенных последовательностей, которые могут служить доменами «считывания» посредством вторичной гибридизации меченого комплементарного олигонуклеотида. Эти преимущества привели к появлению растущего набора методов пространственных геномики и транскриптомики, в которых используются сложные наборы зондов [35], состоящие из нескольких типов олигонуклеотидов в сочетании с повторяющимися раундами вторичной гибридизации для визуализации десятков геномных областей и тысяч или более типов РНК соответственно в одном и том же образце клетки или ткани. Олигонуклеотидные зонды для FISH могут быть разработаны для конкретного участка целевой хромосомымишени. WCP-зонды (whole chromosome painting – окрашивание целых хромосом) [36] и представляют собой набор олигонуклеотидных фрагментов ДНК, которые равномерно покрывают хромосому по всей ее длине или только ее часть (например, короткое и длинное плечи). Они гибридизуются на обоих хромосомных гомологах и используются только на метафазных хромосомах, выявляя хромосомные перестройки (транслокации и др.) различной сложности. Центромерные зонды или зонд-счетчик хромосом полностью или относительно специфичны к тандемным α-и β-сателлитным повторам, расположенным в основном в центромерных и околоцентромерных гетерохроматиновых областях хромосом [37]. Известен также метод COMBO-FISH (COMBinatorial Oligonucleotide FISH), основанный на перекрывающихся зондах, для чего используется биоинформатический поиск в базах данных последовательностей [38]. Мультицветные и мультиплексные платформы для молекулярно-цитогенетического анализа. Одной из передовых и многообещающих модификаций FISH-анализа является мультиплексная модификация (m-FISH), реализующаяся в виде 24-цветной платформы кариотипирования человеческого генома. Эта платформа была предложена для изучения сложных межхромосомных перестроек и выявления патологических хромосом [39]. Уникальная многоцветная технология основана на трех основных особенностях: (1) мультиплексное мечение всех хромосом в геноме определенным числом спектрально различных флуорофоров комбинаторным способом, так что каждая гомологичная пара хромосом помечается уникальным способом; (2) микроскопическая визуализация и получение цифрового сигнала от каждого флуорофора с использованием специальных наборов однополосных фильтров и специального программного обеспечения m-FISH. Наложение полученных изображений друг на друга, что позволяет классифицировать отдельные хромосомы по составу флуорофоров; (3) детальный анализ и постобработка изображений для устранения структурных и численных аномалий [40]. Другая интересная платформа, разработанная в недавнем исследовании [41], основана на зондах многоцветного окрашивания для каждой пары хромосом. Этот метод позволяет точно определять точки разрыва перестроенных хромосом, внутрихромосомные аномалии (делеции, инверсии, инсерции) и идентифицировать гены-кандидаты, участвующие в нарушении. Известны также и другие мультиплексные технологии FISH, именуемые авторами-разработчиками аббревиатурами, определяемыми как MERFISH, MINA, OligoFISSEQ, OligoSTORM, ORCA, seqFISH+. Подробный анализ перечисленных технологий приведен в недавнем обзоре [42]. Клинически одобренные наборы реагентов для молекулярно-цитогенетической диагностики. Современный перечень средств и методов, включенных в мировые стандарты первичной диагностики и мониторинга гематологических заболеваний, таких как острый и хронический миелолейкозы, острый лимфобластный и хронический лимфолейкозы, множественная миелома, миелодиспластический синдром, неходжкинская лимфома, постоянно обновляется и модифицируется. Тем не менее диагноз методом FISH достоверно фиксируется Всемирной организацией здравоохранения на уровне клинических рекомендаций по указанным нозологиям. Коммерчески доступные наборы реагентов на основе метода FISH для диагностики онкогематологических заболеваний, включающие протяженные зонды на основе технологии BAC с возможностью прямого мечения, предложены в США фирмами Abbott (технология VYSIS IntelliFISH) [43] и Leica (технология зондов Kreatech FISH) [44], в Германии – компанией Metasystems (технология многоцветного мечения mFISH) [45]. Одними из наиболее известных производителей реагентов для FISH-диагностики на основе технологий олигонуклеотидных зондов являются Agilent, США, с запатентованной технологией SureFISH [46] и Biosearch Technologies, США (технология Stellaris™ RNA FISH) [47]. Помимо разработки реагентов класса IVD, производители уделяют большое внимание созданию исследовательских наборов и компонентов для молекулярно-цитогенетического анализа как одного из наиболее мощных инструментов современных биомедицинских исследований. В исследовательских целях метод FISH активно используется для изучения патологических процессов в кроветворении. Например, в недавнем исследовании [48] описано применение метода FISH на CD34+-клетках пациентов с хроническим лимфоцитарным лейкозом с успешной оценкой цитогенетических изменений в соответствующей фракции CD19+-клеток. Китайская биотехнологическая компания Wuhan Healthcare производит широкий спектр ДНК-зондов для патоморфологических и онкогематологических исследований методом FISH и его модификациями. Компания разработала и запатентовала технологию FastProbe® [49], которая позволяет сократить время гибридизации при FISH-анализе с 16 до 2 ч, повысить чувствительность и специфичность зонда, уменьшить фоновое окрашивание и получить четкий и яркий флуоресцентный сигнал. Что касается отечественных разработок, имеются фрагментарные сведения относительно создания тест-систем для клинического молекулярно-цитогенетического анализа [50]. Заключение. В ходе проведенного критического анализа исследований последних десятилетий установлено, что при разработке новых платформ для молекулярно-цитогенетической детекции клинически значимых геномных перестроек ключевой является технология FISH и ее модификации, в частности технология картирования генома на основе CMA, многоцветный FISH для анализа мультихромосомных локусов, высокоразрешающий FISH на основе олигонуклеотидных зондов. Обзор будет полезен исследователям, специализирующимся на фундаментальных проблемах патологий генетической этиологии на уровне хромосомных аберраций, понимании функционирования хромосомного аппарата клеточных систем в норме и переходных состояниях соответственно. Кроме того, обобщенная информация будет полезна практикующим клиницистам в вопросе о наиболее перспективных способах рутинной диагностики социально значимых заболеваний с использованием мощных и высокопроизводительных методов, основанных на хромосомном и молекулярно-цитогенетическом вариантах анализа. Источники финансирования. Работа выполнена в рамках государственного задания ФГБОУ ВО «Саратовский государственный медицинский университет им. В.И. Разумовского» Минздрава России «Разработка технологии создания перспективных тест-систем на основе высокоразрешающих флуоресцирующих ДНК-нанометок для молекулярно-цитогенетической диагностики хромосомных болезней» (регистрационный номер 124020300001-9). Вклад авторов: Т.Е. Пылаев – дизайн статьи, обработка данных, написание и редактирование рукописи; С.С. Веретенников – поиск источников литературы, редактирование рукописи. Все авторы одобрили финальную версию статьи перед публикацией, выразили согласие нести ответственность за все аспекты работы, подразумевающую надлежащее изучение и решение вопросов, связанных с точностью или добросовестностью любой части работы. Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Литература:
1. Hu L, Ru K, Zhang L, et al. Fluorescence in situ hybridization (FISH): An increasingly demanded tool for biomarker research and personalized medicine. Biomark Res. 2014;2(1):3. DOI:10.1186/2050-7771-2-3
2. Nouri-Aria KT. In situ hybridization. Methods Mol Med. 2008;138:331-47. DOI:10.1007/978-1-59745-366-0_27
3. Gozzetti A, Le Beau MM. Fluorescence in situ hybridization: Uses and limitations. Semin Hematol. 2000;37(4):320-33. DOI:10.1016/s0037-1963(00)90013-1
4. Cui C, Shu W, Li P. Fluorescence in situ hybridization: Cell-based genetic diagnostic and research applications. Front Cell Dev Biol. 2016;4:89. DOI:10.3389/fcell.2016.00089
5. Belaud-Rotureau MA, Elghezal H, Bernardin C, et al. Le caryotype spectral (SKY): principe, avantages et limites en cytogénétique constitutionnelle et tumorale [Spectral karyotyping (SKY) principle, avantages and limitations]. Ann Biol Clin (Paris). 2003;61(2):139-46. PMID:12702468
6. Mizuno Y, Chinen Y, Tsukamoto T, et al. A novel method of amplified fluorescent in situ hybridization for detection of chromosomal microdeletions in B cell lymphoma. Int J Hematol. 2019;109(5):593-602. DOI:10.1007/s12185-019-02617-x
7. Hu H, Wang L, Wu J, et al. Noninvasive prenatal testing for chromosome aneuploidies and subchromosomal microdeletions/ microduplications in a cohort of 8141 single pregnancies. Hum Genomics. 2019;13(1):14. DOI:10.1186/s40246-019-0198-2
8. Tsukamoto T, Kinoshita M, Yamada K, et al. Imaging flow cytometry-based multiplex FISH for three IGH translocations in multiple myeloma. J Hum Genet. 2023;68(7):507-14. DOI:10.1038/s10038-023-01136-2
9. Bastard C, Caumont C, Samaison L, et al. Fluorescent in situ hybridization testing allows the diagnosis of NRG1 gene fusions in lung and pancreas cancers with no other identified oncogenic driver. Cancers (Basel). 2025;17(14):2347. DOI:10.3390/cancers17142347
10. Acosta AM, Fletcher CDM, Sholl LM, et al. Fluorescence in-situ hybridization assessment of spindle cell-rich testicular sex cord stromal tumors demonstrates multiple chromosomal gains across histologic subtypes. Hum Pathol. 2024;153:105652. DOI:10.1016/j.humpath.2024.105652 11. Kwon S. Single-molecule fluorescence in situ hybridization: quantitative imaging of single RNA molecules. BMB Rep. 2013;46(2):65-72. DOI:10.5483/bmbrep.2013.46.2.016
12. Цаур Г.А., Ольшанская Ю.В., Обухова Т.Н. и др. Цитогенетическая и молекулярногенетическая диагностика онкогематологических заболеваний: позиция Организации молекулярных генетиков в онкологии и онкогематологии. Гематология и трансфузиология. 2023;68(1):129-43. DOI:10.35754/0234-5730-2023-68-1-129-1432010
13. Román-Lladó R, Aguado C, Jordana-Ariza N, et al. Fluorescence in situ hybridization (FISH) for the characterization and monitoring of primary cultures from human tumors. J Mol Pathol. 2023;4:5768. DOI:10.3390/jmp4010007
14. Setty P, Hammes J, Rothämel T, et al. A pyrosequencingbased assay for the rapid detection of IDH1 mutations in clinical samples. J Mol Diagn. 2010;12(6):750-756. DOI:10.2353/ jmoldx.2010.090237
15. Atli EI, Gurkan H, Atli E, et al. The importance of targeted next-generation sequencing usage in cytogenetically normal myeloid malignancies. Mediterr J Hematol Infect Dis. 2021;13(1):e2021013. DOI: 10.4084/MJHID.2021.013
16. Do CH, Bailey S, Macardle C, et al. Development of locus specific sub-clone separation by fluorescence in situ hybridization in suspension in chronic lymphocytic leukemia. Cytometry A. 2017;91(11):1088-95. DOI:10.1002/cyto.a.23264
17. Mühlbacher V, Haferlach T, Kern W, et al. Array-based comparative genomic hybridization detects copy number variations with prognostic relevance in 80% of ALL with normal karyotype or failed chromosome analysis. Leukemia. 2016;30(2):318-324. DOI:10.1038/leu.2015.276.
18. Batzir NA, Shohat M, Maya I. Chromosomal microarray analysis (CMA) a clinical diagnostic tool in the prenatal and postnatal settings. Pediatr Endocrinol Rev. 2015;13(1):448-54. PMID:26540760
19. Ribeiro IP, Melo JB, Carreira IM. Cytogenetics and cytogenomics evaluation in cancer. Int J Mol Sci. 2019;20(19):4711. DOI:10.3390/ijms20194711
20. Manning M, Hudgins L; Professional Practice and Guidelines Committee. Array-based technology and recommendations for utilization in medical genetics practice for detection of chromosomal abnormalities. Genet Med. 2010;12(11):742-5. DOI:10.1097/GIM.0b013e3181f8baad
21. Levy B, Wapner R. Prenatal diagnosis by chromosomal microarray analysis. Fertil Steril. 2018;109(2):201-12. DOI:10.1016/j.fertnstert.2018.01.005
22. Qi QG, Tuo Y, Liu LX, et al. Amniocentesis and next generation sequencing (NGS)-based noninvasive prenatal DNA testing (NIPT) for prenatal diagnosis of fetal chromosomal disorders. Int J Gen Med. 2021;14:1811-7. DOI:10.2147/IJGM. S297585
23. Mazzonetto PC, Villela D, Krepischi ACV, et al. Lowpass whole genome sequencing as a cost-effective alternative to chromosomal microarray analysis for low- and middleincome countries. Am J Med Genet A. 2024;194(11):e63802. DOI:10.1002/ajmg.a.63802
24. O’Connor SJM, Turner KR, Barrans SL. Practical application of fluorescent in situ hybridization techniques in clinical diagnostic laboratories. Methods Mol Biol. 2020;2148:35- 70. DOI:10.1007/978-1-0716-0623-0_3
25. Grati FR, Malvestiti F, Gallazzi G, et al. Performance of conventional cytogenetic analysis on chorionic villi when only one cell layer, cytotrophoblast or mesenchyme alone, is analyzed. Prenat Diagn. 2021;41(6):652-60. DOI:10.1002/pd.5941
26. Breman A, Patel A. Preparation of chorionic villus samples for metaphase chromosome analysis and chromosomal microarray analysis. Curr Protoc Hum Genet. 2012;Chapter 8:Unit8.3. DOI:10.1002/0471142905.hg0803s75
27. Babu R, Van Dyke DL, Dev VG, et al. Interphase chromosome profiling: A method for conventional banded chromosome analysis using interphase nuclei. Arch Pathol Lab Med. 2018;142(2):213-28. DOI:10.5858/arpa.2016-0621-OA
28. Jensen E. Technical review: In situ hybridization. Anat Rec (Hoboken). 2014;297(8):1349-53. DOI:10.1002/ar.22944
29. Smith DR. Random primed labeling of DNA. Methods Mol Biol. 1993;18:445-447. DOI:10.1385/0-89603-245-0:445
30. Green MR, Sambrook J. Labeling of DNA probes by nick translation. Cold Spring Harb Protoc. 2020;2020(7):100602. DOI:10.1101/pdb.prot100602
31. Keller GH, Huang DP, Manak MM. Labeling of DNA probes with a photoactivatable hapten. Anal Biochem. 1989;177(2):392- 395. DOI:10.1016/0003-2697(89)90072-9
32. Wise JL, Crout RJ, McNeil DW, et al. Cryptic subtelomeric rearrangements and X chromosome mosaicism: a study of 565 apparently normal individuals with fluorescent in situ hybridization. PLoS One. 2009;4(6):e5855. DOI:10.1371/journal. pone.0005855
33. Osoegawa K, Mammoser AG, Wu C, et al. A bacterial artificial chromosome library for sequencing the complete human genome. Genome Res. 2001;11(3):483-496. DOI:10.1101/ gr.169601.
34. Yamada NA, Rector LS, Tsang P, et al. Visualization of fine-scale genomic structure by oligonucleotide-based highresolution FISH. Cytogenet Genome Res. 2011;132(4):248-54. DOI:10.1159/000322717
35. Beliveau BJ, Joyce EF, Apostolopoulos N, et al. Versatile design and synthesis platform for visualizing genomes with Oligopaint FISH probes. Proc Natl Acad Sci U S A. 2012;109(52):21301-6. DOI:10.1073/pnas.1213818110
36. Takei Y, Yun J, Zheng S, et al. Integrated spatial genomics reveals global architecture of single nuclei. Nature. 2021;590(7845):344-50. DOI:10.1038/s41586-020-03126-2
37. Andrade BLF, Lopes ALG, Teixeira GA, Tavares MG. Karyotypes and chromosomal mapping of some repetitive dnas in two stingless bee species (apidae: Meliponini), with the description of a B chromosome in plebeia genus. Cytogenet Genome Res. 2024;164(5-6):267-75. DOI:10.1159/000542295
38. Hausmann M, Lee JH, Sievers A, et al. COMBinatorial Oligonucleotide FISH (COMBO-FISH) with uniquely binding repetitive dna probes. Methods Mol Biol. 2020;2175:65-77. DOI:10.1007/978-1-0716-0763-3_6
39. Anderson R. Multiplex fluorescence in situ hybridization (M-FISH). Methods Mol Biol. 2010;659:83-97. DOI:10.1007/978- 1-60761-789-1_6
40. Onozato ML, Yapp C, Richardson D, et al. Highly multiplexed fluorescence in situ hybridization for in situ genomics. J Mol Diagn. 2019;21(3):390-407. DOI:10.1016/j. jmoldx.2019.01.010 41. Liehr T, Starke H, Weise A, et al. Multicolor FISH probe sets and their applications. Histol Histopathol. 2004;19(1):229-37. DOI:10.14670/HH-19.229
42. Yan Y, Liheng Y, Leyuan M, et al. Introduction to bioimaging-based spatial multi-omic novel methods. Quantitative Biol. 2023;11:231-45. DOI:10.15302/J-QB-023-0332
43. Anderson T, Hartman S, Dunn W, et al. Technical comparison of Abbott’s UroVysion® and Biocare’s CytoFISH urine fluorescence in situ hybridization (FISH) assays. Cancer Cell Int. 2023;23(1):314. DOI:10.1186/s12935-023-03156-6
44. Kwon GJ, Blackley A, Perkinson K, et al. Automation of fluorescent in situ hybridization (FISH) leading to cost savings and consistent high-quality results. J Clin Pathol. DOI:10.1136/ jcp-2025-210119
45. Martinez G, Gillois P, Le Mitouard M, et al. FISH and tips: A large scale analysis of automated versus manual scoring for sperm aneuploidy detection. Basic Clin Androl. 2013;23:13. DOI:10.1186/2051-4190-23-13
46. Sugita S, Aoyama T, Ito Y, et al. Diagnostic utility of automated SureFISH (Dako Omnis) in the diagnosis of musculoskeletal translocation-related sarcomas. Pathol Int. 2017;67(10):510-3. DOI:10.1111/pin.12562
47. Soler M, Boque-Sastre R, Guil S. RNA-FISH to study regulatory RNA at the site of transcription. Methods Mol Biol. 2017;1543:221-9. DOI:10.1007/978-1-4939-6716-2_12
48. Quijada-Álamo M, Hernández-Sánchez M, Robledo C, et al. Next-generation sequencing and FISH studies reveal the appearance of gene mutations and chromosomal abnormalities in hematopoietic progenitors in chronic lymphocytic leukemia. J Hematol Oncol. 2017;10(1):83. DOI:10.1186/s13045-017-0450-y
49. Suh J, Liu Y, Smith J, Watanabe M, et al. A simple and fast optical clearing method for whole-mount fluorescence in situ hybridization (FISH) Imaging. J Biophotonics. 2025;18(12):e202400258. DOI:10.1002/jbio.202400258
50. Vorsanova SG, Yurov YB, Iourov IY. Quantitative FISHing: Implications for Chromosomal Analysis. Methods Mol Biol. 2024;2825:239-46. DOI:10.1007/978-1-0716-3946-7_13